میکروسکوپ فلورسانس
روشی برای گرفتن تصویرهای میکروسکوپی با استفاده از فلورسانس برانگیخته شده در نمونه.
میکروسکوپ فلورسانس

تعریف: روشی برای گرفتن تصویرهای میکروسکوپی با استفاده از فلورسانس برانگیخته شده در نمونه.
تصویر برداری میکروسکوپی فلورسانس روشی است برای تصویربرداری از نمونه ها (معمولاً مواد بیولوژیک) با استفاده از فلورسانس داخل نمونه که معمولاً با استفاده از یک پرتو لیزر محدود شده با پراش و به شدت متمرکز  برانگیخته می شود. اشعه لیزر متمرکز بصورت هاشوری نمونه را می روبد (بوسیله آینه های گالوو) و نور برانگیخته فلورسانس در نمونه بوسیله اجزای نوری جمع شده و با آشکارسازهای نوری مشاهده و بررسی می شود. نور لیزر باقیمانده می تواند با فیلتر نوری قبل از آشکارساز حذف شود. میکروسکوپ فلورسانس معمولاً با یک کامپیوتر کار می کند که روبش را کنترل می کند و شدت های فلورسانس را ضبط می کند. در نهایت تصاویر گرفته شده را تولید، فرآوری و ذخیره می کند.

 
شکل 1- چیدمان یک میکروسکوپ فلورسانس هم کانون.
 
به طور معمول در این میکروسکوپ از هندسه هم کانون (شکل 1) استفاده می شود که در آن نور از نقطه تمرکز در نمونه به درون یک شکاف تصویر منتقل می شود تا نور آمده از مناطق دیگر حذف شود. این هندسه امکان استفاده از نمونه های نسبتاً ضخیم را در مقایسه با روش میکروسکوپی معمول فراهم می‌کند.
فلورسانس می تواند از مولکولهایی نشأت بگیرد که به طور طبیعی در نمونه وجود دارند یا ناشی از مولکولهای رنگی باشد که در هنگام آماده سازی نمونه اضافه شده اند. کنتراست تصویر تحت تأثیر تغییر غلظت مولکولهای فلورسانس یا اثرگذاری بر این مولکولها که برای مثال عمر فلورسنت آنها را تغییر دهد، است.
در ساده ترین شکل تصویر برداری میکروسکوپی فلورسانس، لیزر به صورت پیوسته کار می کند و طول موج آن طوری انتخاب می شود که در محدوده طیف جذبی مولکولهای فلورسنت باشد تا با جذب تک فوتون برانگیخته شود. 
  • تصویربرداری میکروسکوپی چندفوتونی
تصویربرداری میکروسکوپی چندفوتونی یک گونة مهم از تصویربرداری میکروسکوپی فلورسانس است که در آن از برانگیختگی چند فوتونی فلورسانس استفاده می شود. در این روش از پالسهای فمتوثانیه یک لیزر قفل مدی استفاده می شود. طول موج این لیزر در ناحیه جذب خطی قرار ندارد، اما جذب چند فوتونی (معمولاً جذب دو یا سه فوتون) به خاطر شدت های بالای قله اتفاق می افتد. در نتیجه طول موج لیزر معمولاً در ناحیه مادون قرمز نزدیک است. تصویربرداری میکروسکوپی فلورسانس چند فوتونی به سیستم گران قیمت تری نیاز دارد، اما مزایای آن بسیار متعدد و قابل توجه است.
 
شکل 2- تصویر میکروسکوپی فلورسانس سلولها، دانشگاه کالیفرنیا.
  • به دلیل طبیعت غیرخطی این روش، جذب در نقطه تمرکز اشعه، متمرکزتر است و در نتیجه تفکیک پذیری در هر دو مسیر محوری و جانبی افزایش می یابد.
  • به دلیل مشابه اشعه لیزر می تواند به لایه های بزرگتری از ماده شفاف و نمونه های ضخیم تر نفوذ کند. همچنین اثرات رنگ زدایی نوری با تمرکز برانگیختگی به ناحیه مفید به حداقل می رسد.
  • در طول موج های مادون قرمز استفاده شده، جذب و پراکنش مثلاً در نمونه های بیولوژیک معمولاً خیلی ضعیف است.
  • از آنجا که فلورسانس برانگیخته شده به طور طبیعی در نقطه تمرکز شدت بیشتری دارد، نیاز به آشکارسازی هم کانون نیست؛ عدم وجود شکاف نوری بازدهی آشکارسازی را افزایش می دهد. در بعضی موارد فلورسانس حتی از کناره ها نیز قابل آشکارسازی است، حتی بیشتر از مسیر اشعه لیزر یا مقابل آن.
  • آشکارسازی کلید زمانی امکان مشاهده و بازرسی شدت های فلورسانس را در بازه های زمانی مشخص بعد از پالسهای برانگیخته فراهم می‌کند. این فرآیند امکان اندازه گیری عمر فلورسانس محلی را می دهد که در نتیجه می توان از آن در تهیه تصویر با کنتراست خوب استفاده کرد. این روش [1]FILM نامیده می شود. یک نوع متفاوت FRET[2] است که در آن از انرژی انتقالی از مولکولهای برانگیخته به دیگر مولکولها در نمونه استفاده می شود. در دیگر روشهای مربوط از لیزرهای با طول موج کوک پذیر برای تهیه اطلاعات اضافه استفاده می شود. به عنوان نمونه بوسیله تنظیم برروی طول موج های جذب مولکولهای فلورسانت مختلف این کار صورت می گیرد.
نوع دیگری از این روش تصویربرداری میکروسکوپیSTED[3]  است. در این روش ابتدا ماده فلورسانس نشانه گذار با پالس دمش گوسی شکل برانگیخته می شود. اندکی بعد پالس دوم با شکل دونات (که شدت صفر در مرکز دارد) به همان نقطه فرستاده می شود. پالس دوم، اندکی طول موج بلندتر دارد و در نتیجه باعث ایجاد تابش برانگیخته می شود که محدوده برانگیختگی را در یک رینگ دور مرکز نقطه اصلی کاهش می دهد. در نتیجه یک محدوده برانگیخته کوچک می ماند و از این می توان برای رسیدن به تفکیک پذیری فضایی زیر 100 نانومتر و حتی تا 20 نانومتر استفاده کرد. این تفکیک پذیری خیلی بهتر از مقادیر ممکن برای میکروسکوپ نوری (به غیر از میکروسکوپ میدان نزدیک) است. به عنوان نمونه می توان گفت محدودیت تفکیک پذیری Abbe شکسته می شود.
در سال 2014، جایزه نوبل در شیمی به ویلیام مورنر، اریک بتزیگ و استفان هل به دلیل "توسعه تصویربرداری میکروسکوپی فلورسانس با تفکیک بسیار بالا" داده شد. در حالیکه استفان هل میکروسکوپ STED را توسعه داده بود و و باقی یک روش دیگر را که میکروسکوپ تک مولکول نامیده می شود گسترش داده بودند. با این جایزه مشخص شد که محدودیت تفکیک پذیری بلند مدت براساس محاسبات ارنست آبه در نهایت رفع شده است. هم اکنون می توان از واژه "نانوسکوپی" به جای تصویر برداری میکروسکوپی برای این روشهای تصویربرداری استفاده کرد؛ زیرا که ساختارها در یک میزان طولی برای اندازه های زیر میکرومتر (در ناحیة نانومتر) در دسترس است. این مسئله بطور اساسی حوزه کاربردهای تصویربرداری میکروسکوپی نوری را گسترش می دهد. شگفت آور است که پیشرفت هایی که بطور مشخص در زمینه فیزیک بوده است، پایه جایزه نوبل در شیمی شده است؛ اما کار اساسی استفان هل در اصل در انستیتو ماکس پلانک برای شیمی بیوفیزیک در گاتینگن انجام شد و کاربردهای مهمی در زمینه شیمی و بیولوژی داشته است.
  • تصویربرداری میکروسکوپی بازسازی تصادفی نوری
یک کلاس متفاوت از روشها برای تصویربرداری میکروسکوپی فلورسانس STORM[4] یا تصویربرداری میکروسکوپی بازسازی تصادفی نوری است که [5](F)PALM نیز گفته می شود. در این روش نمونه (معمولاً مواد بیولوژیک) به گونه ای آماده می شود که شامل غلظت کمی از مولکولهای فلورسنت معین باشد و به طور مرجح مکانهای مشخصی در نمونه (مثلاً microtubules در سلولها) را اشغال کند. اگر تعداد بالای کافی فوتونهای فلورسانس از هر مولکول آشکارسازی شود، این مولکولهای فلورسنت (فلوروفور، برچسب های فلورسنت) با یک تفکیک پذیری زیر محدوده پراش می توانند در یک محل متمرکز شوند. این حالت به شرطی است که فلوروفورها فاصله متقابل به میزان کافی بزرگ از هم داشته باشند (تصویر چنین مولکولی، یک نقطه از اندازه بزرگ است، اما مرکز آن در صورتی که نقاط مختلف روی هم نیافتاده باشند بصورت دقیق می تواند تعیین شود).
یک تصویر تکی گرفته شده با چنین روشی تنها مکانهای مشخصی که مکان فلوروفورها هستند را آشکار می کند. یک تصویر کامل از ترکیب چند عکس در حالیکه چیدمان های مختلف فلوروفورها فعال شده، بدست می آید. فعال سازی و غیرفعال سازی فلوروفورها بوسیله تأثیر روبش اشعه لیزر اتفاق می افتد، زیرا فلوروفورها می توانند بین حالت فلورسانت و حالت "تاریک" سوییچ شوند.
  • کاربردها
همانطور که در بالا اشاره شد، تصویربرداری میکروسکوپی فلورسانس بیشتر برای نمونه های بیولوژیک مانند کاربردهای تشخیص پزشکی، استفاده می شود. در حال حاضر در تحقیقات از تصویربرداری میکروسکوپی فلورسانس برای تشخیص سرطان استفاده می شود. همچنین تصویربرداری سلولهای زنده نیز امکان پذیر است. مخصوصاً با تصویربرداری میکروسکوپی فلورسانس چند فوتونی، امکان تماشای تقسیم سلولی بدون تأثیرگذاری مخرب شدید روی سلولها وجود دارد. سلولها معمولاً نمی توانند برانگیختگی تک-فوتونی را برای دوره های زمانی بلند مدت تحمل کنند.
 
 
 

[1] Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy
[2] Fluorescence Resonant Energy Transfer
[3] Stimulated Emission Depletion
[4] Stochastic Optical Reconstruction Microscopy
[5] (Fluorescence) Photoactivation Localization Microscopy
 


   |    1397/4/5