افزایش فلوسایتومتری با یک منبع جدید لیزری ماوراء بنفش با طول موج 320 نانومتر
فلوسایتومتری[1] یک تکنیک اساسی در علوم زیست پزشکی است که در آن برچسب های فلورسنت مولکولی متصل شده به سلول ها با لیزر برانگیخته می شوند.
افزایش فلوسایتومتری با یک منبع جدید لیزری ماوراء بنفش با طول موج 320 نانومتر

فلوسایتومتری[1] یک تکنیک اساسی در علوم زیست پزشکی است که در آن برچسب های فلورسنت مولکولی متصل شده به سلول ها با لیزر برانگیخته می شوند و با استفاده از تیوب های فوتو مولتی پلایر[2] (PMT) و دیگر فناوری های نور سنجی، آشکارسازی می شوند (شکل 1). سلول ها در یک جریان مایع که به صورت هیدرودینامیکی متمرکز شده است[3] با پرتو لیزر برخورد می کنند.

 
شکل 1- طرحواره ای که عملکرد یک فلوسایتومتر ابتدایی را نشان می دهد. سلول ها در یک جریان مایع که به صورت هیدرودینامیکی بوسیله یک نازل[4] یا کوارتز محصور شده، متمرکز شده اند با پرتو لیزر برخورد می کنند. عدسی های جمع کننده، سیگنال های فلورسانس تحریک شده را با بکارگیری آینه های دو رنگی[5] و فیلترهای میان گذر به سمت PMT­ها هدایت می کنند. در دستگاه های جدید می توان از فیبر نوری برای انتقال پرتو لیزر و جمع کردن سیگنال دریافتی استفاده کرد.

برخی از فلوسایتومترها تنها برچسب های فلورسنت متصل به سطح یا داخل سلول ها را آنالیز می کنند. در دسته بندی سلولی فعال شده با فلورسان[6] (FACS) جریان مایع به قطره تبدیل می شود و قطره ها به صورت الکترواستاتیکی باردار شده و وارد لوله های جمع آوری کننده می شوند. دسته بندی سلولی که اجازه جداسازی و جمع آوری سلول ها را بر اساس برچسب زدن فلورسنت می دهد، سبب می شود سلول های جمع آوری شده برای مطالعات کاربردی و تحلیل پروتئومیک[7] و ژنومیک[8] استفاده شوند.
فلوسایتومتری یک ابزار حیاتی در گسترش درک ما از سیستم ایمنی بدن، بیولوژی سرطان و بیماری های عفونی است. پروب های فلورسانی استفاده شده در برچسب زنی به سلول ها برای این تکنیک، می توانند انواع سلول های خاص در ترکیبات پیچیده و همچنین مشخصات فیزیکی و فیزیولوژیکی تک سلولی ­ها را  شناسایی کنند.

پیشینه لیزرها در فلوسایتومتری
فلوسایتومتری کاملاً وابسته به تکنولوژی لیزر است. لیزر سبب می شود برچسب های فلورسان برانگیخته شوند [1]. در اولین فلوسایتومتری از تک لیزرهایی استفاده می شد (در آن زمان، عموماً لیزرهای یونی بزرگ آب خنک بود) که برای تحریک یک یا دو پروب فلورسان، شامل فلوروکروم های متداول مانند فلورسین[9] و رودامین[10]، بکار می رفت. در حال حاضر فلوسایتومترهای مدرن از لیزرهای حالت جامد با طول موج فرابنفش (تقریباً 355 نانومتر) تا مادون قرمز (تقریباً 700 نانومتر) که شامل طیف نور مرئی هم می شود، استفاده می کنند.
سایتومترهای پیشرفته می توانند با 10 لیزر تک طول موج مجزا که اجازه تحریک انواع زیادی از پروب های فلورسان را با تغییر مشخصات برانگیزش/گسیل می دهند، مجهز شوند. در حالیکه ابزارهای ابتدایی تنها می توانستند یک یا دو پروب را تحریک و آشکارسازی کنند، در حال حاضر آشکارسازی همزمان 30 یا تعداد بیشتری از پروب های فلورسان با ابزارهای پیشرفته امکان پذیر است. آنالیز با این ابعاد بالا، دانش ما را از سیستم ایمنی به سطح بی نظیری گسترش داده است.
فلوسایتومترهای مدرن از تعداد زیادی طول موج­ لیزری و پروب های فلورسان متناظر آن در آنالیز همزمان 20 یا تعداد بیشتری از ویژگی های سلولی استفاده می کنند. دستگاه های مدرن معمولاً با یک لیزر آبی متمایل به سبز (488 نانومتر)، یک دیود لیزر قرمز (تقریباً 640 نانومتر) و یک لیزر حالت جامد پمپ شده دیودی[11] (DPSS) سبز، سبز-زرد یا زرد (532، 552 یا 561 نانومتر) مجهز خواهند شد. این لیزرها همگی انواع فلوروکروم ها[12] را برانگیخته می کنند (شکل 2).

 
شکل 2- نمونه ای از پروب های فلورسان مورد استفاده در فلوسایتومتری که با طول موج های لیزر مورد نیاز برای برانگیختگی هماهنگ شده است. اکثر این پروب ها از نظر طیفی سازگار هستند و می توانند بطور همزمان در دستگاه هایی با آرایه کاملی از طول موج های لیزری استفاده شوند (رنگینه های آبی درخشان[13](BB)، سبز زرد درخشان (BYG)[14]، بنفش درخشان (BV)[15] و فرابنفش درخشان  (BUV)[16] با علامت تجاری  BD Sirigen ثبت شده اند و رنگینه های Pacific Blue،  Alexa Fluor 647 و Alexa Fluor 790 با علامت تجاری Thermo Fisher, Inc ثبت شده اند).

لیزر دیودهای بنفش، با توسعه رنگینه های پلیمری بنفش درخشان  (BV)با نام تجاری BD Sirigen، منابع مهم برانگیزش هستند [2]. رنگینه ­های شرکت Seven BV (BV421، BV480، BV570، BV605، BV650 و BV787) نیز در دسترس هستند که از نظر طیفی سازگار و بطور فزاینده ای تعداد نشانگرهای سلولی که به طور همزمان می توانند آنالیز شوند را افزایش می دهند. لیزرهای فرابنفش (UV) نیز با پیشرفت اخیر در 6 رنگینه ماورا بنفش درخشان (BUV395، BUV496، BUV661، BUV737 و BUV805) سبب پیشرفت جدیدی در فلوسایتومتری شده اند و باعث شده تعداد کل تحلیل های همزمان فلورسان تا حدود 30 افزایش یابد. در حال حاضر لیزرهای UV یک جزء حیاتی در دستگاه فلوسایتومتری مدرن هستند.
فلوسایتومترهای مدرن برای تحریک BUV و سایر رنگینه ­هایی که با UV برانگیخته می شوند، عمدتاً از هارمونیک سوم لیزرهای حالت جامد Nd:YVO4 در طول موج 355 نانومتر استفاده می کنند. این لیزرها بدلیل کوچکتر بودن و هزینه بسیار کم نگهداری، پیشرفت قابل توجهی نسبت به لیزرهای یون آرگون و یون کریپتون که قبلاً برای برانگیزش UV مورد نیاز بود، داشته اند. با این حال، آن ها گران هستند و در مقایسه با سایر المان ها گران قیمت ترین هستند.
دیود لیزرهای ارزان تر نزدیک به UV (375 نانومتر) می توانند برای بسیاری از رنگینه هایی که با UV برانگیخته می شوند (شامل BUVها)، جایگزین منابع 355 نانومتری شوند [3]. با این حال، طول موج آن ها بسیار نزدیک به محدوده گسیل BUV395 یعنی کوتاه ترین آن ها است که این آشکارسازی را مشکل می کند. بنابراین یک لیزر UV حالت جامد ارزان تر برای کاهش قیمت فلوسایتومتری چندکاره مورد نیاز است.

ماژول لیزر 320 نانومتری کم حجم
این وضعیت با توسعه یک ماژول کوچک لیزر حالت جامد 320 نانومتری پیوسته (CW) هوا خنک توسط شرکت LASOS آلمان، تغییر کرده است. فلوسایتومترها از قدیم با لیزرهای هلیوم-کادمیوم (HeCd) تجهیز می شدند تا با بهره گیری از خط لیزر 325 نانومتری، رنگینه های UV را تحریک کنند. اما لیزرهای HeCd بزرگ هستند، توان بالایی ندارند و به مرور زمان، سر و صدای زیادی تولید می کنند. پیش بینی شده است که بر اساس طیف تحریکی، این منبع 320 نانومتری در محدوده بسیار نزدیک به این طول موج، رنگینه های BUV را به خوبی تحریک کند.
برای آزمایش اینکه این منبع و طول موج لیزر برای فلوسایتومتری قابل استفاده است، ماژولی بر روی یک فلوسایتومتر BD LSR II به عنوان جایگزین منبع لیزر متداول 355 نانومتری UV نصب شد (شکل a3) [4]. سپس لیزر در مسیر جریان مایع که در تزریق سلول استفاده می شد، قرار داده شد. قطعات اپتیکی دستگاه که در اصل برای منبع لیزر 355 نانومتری طراحی شده بودند به دلیل پهنای طیفی وسیع آن ها در طول موج 320 نانومتری نیز کارایی داشته و با استفاده از این آینه ها پرتو لیزر به جریان نمونه رسیده و توسط عدسی های فیوزد سیلیکا بر روی نمونه متمرکز شدند.
 
شکل 3(a) - تصویری از ماژول لیزر 320 نانومتری LASOS که بسیار کم حجم است. (b) ترکیب میکروکره های InSpeck Blue (هفت تا) با منابع لیزری 320 نانومتری (بالا) و 355 نانومتری (پایین) در 20 میلی وات آنالیز شدند. (c و d) سلول های طحال[17] موش  که با BUV563 یا BUV661 علامت گذاری شده اند، با منابع لیزری 320 نانومتری (بالا) و 355 نانومتری (پایین) در 20 میلی وات آنالیز شدند. خطوط رنگی، سلول های برچسب زده شده را نشان می دهد در حالیکه خطوط خاکستری کنترل ­های بدون برچسب را نشان می دهد. منحنی های طیفی مربوط به استفاده از فیلترهای میان گذر که برای سلول های برچسب زده شده میکروکره های InSpeck Blue برای رنگینه های BUV463 و BUV661 استفاده شده است، در زیر نمودارها نشان داده شده است.

فلوسایتومتری از میکروکره های پلیمری با برچسب فلوروکروم بعنوان نمونه های شبیه سازی شده برای تشخیص اینکه آیا دستگاه به صورت بهینه عمل می کند یا خیر و همچنین برای آزمایش منابع لیزری جدید، استفاده می کند. در این آزمایش آنالیز ترکیبی از میکروکره های تاریک و روشن برانگیخته شده با نور UV (میکرو کره های با نام تجاری InSpeck Blue, Thermo Fisher, Eugene, OR) انجام شد که تفکیک پذیری تاریکترین جمعیت، نشان دهنده برانگیختگی و آشکارسازی خوب بود. کم نورترین این میکروکره ها، به راحتی با این منبع لیزری قابل شناسایی بودند (شکل b3). به علاوه در سطح توانی یکسان، حساسیت اندازه گیری مشابه لیزر 355 نانومتری بود. در مرحله بعد سلول های طحال موش به منظور نشانگر کردن سطح سلول، در حالیکه از یک آنتی بادی متصل به دو رنگینه BUV یعنی BUV563 و BUV661 استفاده می کردند، برچسب زده شدند. ماژول 320 نانومتری این نمونه­ ها را تقریباً به خوبی منبع 355 نانومتری، برانگیخته کرد (شکل ­های c3 و d3).  
بنابراین، ثابت شد که منبع لیزر 320 نانومتری LASOS جایگزین خوبی برای برانگیزش 355 نانومتری در فلوسایتومتری است. این ماژول­ ها کوچک تر هستند و از اکثر منابع 355 نانومتری ارزان تر هستند بنابراین یک جایگزین اقتصادی مناسب در فلوسایتومتری­ با ابعاد بالا است. منابع لیزر حالت جامد با ابعاد کوچک در این محدوده از طیف و همچنین نور مرئی، فلوسایتومتری را با کاهش اندازه، هزینه و نیازهای مربوط به تعمیر و نگهداری این دستگاه مدرن، متحول کرده است. این یک روند دلگرم کننده در توسعه تکنولوژی است و به دستگاه های آنالیز کننده زیست پزشکی، کمک بیشتری خواهد کرد.
 
References
1. W. G. Telford, Methods Cell Biol., 102, 375–410 (2011); doi:10.1016/b978-0-12-374912-3.00015-8.
2. P. K. Chattopadhyay et al., Cytometry A, 81, 456–466 (2012).
3. W. G. Telford, Cytometry A, 87, 1127–1137 (2015).
4. W. G. Telford, L. Strickland, and M. Koschorreck, Cytometry A, 91, 314–325 (2017).
 
Source: http://www.laserfocusworld.com/articles/print/volume-53/issue-09/features/lasers-for-the-biosciences-novel-ultraviolet-320-nm-laser-source-enhances-flow-cytometry.html
 
 

[1] Flow Cytometry
[2] Photomultiplier Tubes
[3] Hydrodynamically Focused Liquid Stream
[4] Nozzle
[5] Dichroic Mirror
[6] Fluorescence-Activated Cell Sorters
[7] Proteomic
[8] Genomic
[9] Fluorescein
[10] Rhodamine
[11] Diode-Pumped Solid-State
[12] Fluorochrome
[13] Brilliant Blue
[14] Brilliant Yellow Green
[15]Brilliant violet
[16] Brilliant Ultraviolet
 
[17] Spleen
 
منبع :  www.laserfocusworld.com    |   

   |    1397/9/28